全站搜索
蓖麻种子毒蛋白的高效凝胶过滤色谱分析
作者:管理员    发布于:2015-11-18 13:17:02    文字:【】【】【

  种子检验-蓖麻种子毒蛋白的高效凝胶过滤色谱分析陆益民1宋光泉1贺铁山2(1仲恺农业技术学院化学与化工系广东广州510225 2仲恺农业技术学院基础部广东广州510225)100主分离纯化得到一种毒蛋白,利用光谱图和反相高效液相色谱来确认毒蛋白的纯度。根据标准相对分子质量曲线,得到它的相对分子质量并与SDSPAGF(十一烷基磺酸纳-聚丙烯酰胺凝胶电泳)所得结果进行比较,用氛基酸自动分析仪测定了其氛基酸组成。

  氨基酸蛋白具有很强的抑制蛋白质合成的功能和很强的细胞毒性,目前国内外学者竞相研究,被广泛用于抗癌免疫毒素。我们根据蓖麻毒蛋白对半乳糖的特殊亲和能力,用琼脂糖凝胶进行分离,用高效凝胶蛋白分离柱,结合光电二极管阵列检测器和反相高效液相色谱对分离峰进行纯度检验,并对制得的蓖麻毒蛋白进行了分子量和氨基酸的测定。

  1实验部分11仪器与试剂LC4A高效液相色谱仪,SPDMA光电二极管阵列检测器(以上均为日本岛津产品)CSFA超声波清洗器(上海超声仪器厂)高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司产品)日立835型氨基酸组成分析仪(日本)磷酸二氢钠,磷酸氢二钠,氯化钠,硫酸铵(均为AR)牛血清蛋白,卵清蛋白,溶菌酶,天花粉蛋白(均为上海生化所产品)蓖麻种子(购于山西定襄农业技术推广中心)12实验方法121蓖麻毒蛋白粗提液的制备0g去壳蓖麻籽,在5mmol/L磷酸缓冲液(PBSpH65含100mmol/LN尤1缓冲液A)中匀浆。

  基金项目:广州市慧源绿色化工有限公司资助(C5040617)。

  的研究。

  匀浆液放置3~4h用四层纱布滤去残渣,过滤后的溶液于15000rmn离心15min小心除去沉淀和溶液表面的白色脂肪,取上清。在上清液中加入固体(NH4)2SO4达到60饱和度,放置2~3h20000rmir离心20min倒去上清,把沉淀溶解在缓冲液A中,并用蒸馈水透析8hX320 000rmin离心20min上清液即为蓖麻毒蛋白粗品(以上均在4°Cf进行)122蓖麻毒蛋白粗提液的分离纯化(pH65)平衡后,将粗提液过柱,先用同一缓冲液A洗脱除去杂蛋白,再用含100mmol/LD半乳糖的磷酸缓冲液B洗脱,流速均为1mlmin在A=280nm处,得两个峰(),峰1为杂蛋白峰,收集峰2的流出液。sephadexG-100凝胶过滤柱(2  2结果与分析21蓖麻毒蛋白相对分子质量的测定000)、天花粉蛋白(27000)、溶菌酶(14000)为标准蛋白,用与相同的分离条件得到相对分子质量与洗脱体积的校正曲线。在相同条件下测出R的保留体积后,根据相对分子质量校正曲线算出R毒蛋白相对分子质量为66500同时按Laammli51的方法在SDSPAGF进行电泳,测出R的相对分子质量为66000两者基本一致。

  22等电点的测定按的方法,蓖麻毒蛋白在圆盘电泳槽中进行IEF.蓖麻毒蛋白浓度为0 2mg/ml每管的上样量为50W 3~5个重复,以不点样为对照。把有蛋白的胶条进行考马斯亮蓝R250染色8h脱色至出现蛋白带,记下蛋白带在胶条中相应的位置。无蛋白的胶条切成0.5cm长的小段,加入含0 5ml双蒸水的试管中,室温摇48h然后用pH计测出每管的pH,绘出标准曲线。根据蛋白带在胶条中相应的位置,从标准曲线上查出R的等电点为PH68 23氨基酸组成的测定氨基酸自动分析仪上进行分析,测得蛋白的氨基酸组成如表1结果以摩尔分数(y)表示。

  表1蛋白氨基酸组成Asp(天门冬氨酸)Leu(亮氨酸)Thr(丝氨酸)Tyr(酪氨酸)Ser(苏氨酸)Phe(苯丙氨酸)Glu(谷氨酸)Lys(赖氨酸)Gly(甘氨酸)Hfc(组氨酸)Ala(丙氨酸)Arg(精氨酸)Pro(脯氨酸)Me(蛋氨酸)Cys(半胱氨酸)Ile(异亮氨酸)Trp(色氨酸)3讨论(1)为了得到纯的蛋白,粗提液必须重复过柱,多次洗脱收集,充分透析去掉杂蛋白。

  (2)鉴定毒蛋白纯度时,用2根串联的Proteinpak125高效蛋白柱,分辨率高,分离效果好,鉴定结果可罪。

  (3)表1中氨基酸组成只是一部分,因蛋白酸解后,色氨酸(Tip)和半胱氨酸(Cys)被破坏不能测定,另外在酸解过程中,谷氨酰胺(Gh)和天门冬酰胺(Asn)分别转化为谷氨酸(Glu)和天门冬氨酸(Asp)进行合并计算。

访问统计
51客服