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细菌液体培养膜过滤法用于鞭毛染色的研究
作者:管理员    发布于:2015-11-12 13:16:47    文字:【】【】【

  中华检验医学杂志12月第28卷第12期临床实验诊断研究*细菌液体培养膜过滤法用于鞭毛染色的研究谷海瀛李凡配制新的肉汤培养基,并将该培养基配制成琼脂平板。使用过滤器过滤培养肉汤,取下滤膜制备菌悬液,制备涂片、鞭毛染色、应用离心法和琼脂平板对照比较评价膜过滤法染色效果,每张涂片不同染色部位观察100个细胞,计算鞭毛细胞所占的百分数。结果22属39种411株细菌使用膜过滤法细胞鞭毛染色率平均78,离心法平均69琼脂平板培养平均为71.结论该肉汤培养基适合于鞭毛发育适合细菌快速生长,能在培养早期进行鞭毛染色,使用肉汤培养基膜过滤法获得好染色结果比离心方法操作快速、可靠液体培养细菌进行鞭毛染色有重要意义。鞭毛的形态、“瘫痪鞭毛”(paralyzedflagela)及鞭毛“双相性”都离不开液体培养鞭毛染色技术111液体培养细菌鞭毛染色技术只有1种离心方法124,该方法操作时间长,染色效果不好。本文研制了一种新的鞭毛肉汤培养基建立了膜过滤法进行鞭毛染色新技术。

  3细菌鞭毛谷氏染色液试剂盒:海南省临床微生物学检测与研究中心研制。

  4培养方法:所有菌株均分别接种鞭毛肉汤管管和琼脂平板,28*C培养5~18h每株菌接种2个肉汤管。

  5鞭毛肉汤参照改良,配制如下:材料和方法1ATCC标准菌株20株,临床分离菌株391株。

  中华检验医学杂志(25°C)完全溶解分装每管3.0mi121°C灭菌15 7标准菌株平板培养后,用接种针轻取菌落,用1.0ml无菌鞭毛肉汤配成0.5麦氏单位。使用前用蒸馏水10倍稀释,装上滤膜的滤器接上10ml注射器。将该菌悬液用过滤器缓缓过滤后,吸取5ml蒸馏水,再缓缓推出蒸馏水,取下滤膜,放入装有12ml无菌蒸饱水直径6on的无菌平皿中,缓慢转动平皿,漂浮5min使细胞均匀分布于蒸饱水中,用该菌悬液制备涂片,每株制备3张涂片。

  8鞭毛肉汤细菌培养后,如果菌液过浓,用蒸馏水调至0.5麦氏单位,按方法2制备涂片,每株菌制备3张涂片。

  10.琼脂平板菌落按制备涂片,每株菌制备3张涂片。

  1L鞭毛染色:根据,按试剂盒说明书操作。

  12鞭毛细胞染色评分:每张染色涂片观察不同染色部位累计100个细胞,同时记录有鞭毛的细胞数,每株菌的3张染色涂片有鞭毛细胞数总和除以300得到评价每株菌平均染色率,每株菌的平均染色率之和除以该菌种株数得到每种菌的平均染色率。

  结果L20株标准菌株平板培养物的2种涂片直接涂片和菌悬液过滤染色评分结果,总体差异不大,直接法获得82,膜过滤法为81*数据表明膜过滤对鞭毛细胞染色数量不影响,但对于弧菌,膜过滤法显著优于平板培养直接涂片鞭毛染色法。膜过滤法不影响鞭毛形态(~3)。

  22属39种细菌411株平板培养和肉汤培养枯草芽胞杆菌ATCC6633肉汤培养膜过滤法鞭毛染色/恶臭假单胞菌ATCC12633肉汤培养膜过滤法鞭毛染色/1斯氏假单胞菌ATCC17588肉汤培养膜过滤法鞭毛染色/100Q斯氏假单胞菌ATCC1758肉汤培养离心法鞭毛染色/1000副溶血弧菌ATCC17802平板培养菌悬液离心法鞭毛染色/ 1000副溶血弧菌ATCC17802琼脂平板培养菌悬中华检验医学杂志12月第28卷第12期鞭毛染色评分比较。39种细菌平板培养鞭毛染色的细胞总平均率为71肉汤培养总平均率为69肉汤培养膜过滤法总平均率为78.细菌鞭毛是细菌的运动器官,这种运动主要体现在液体中的运动,因此液体培养更适合于细菌鞭毛发育,但以前的研究证实,肉汤培养和平板培养鞭毛染色效果无差别,尽管在肉汤培养后加入甲醛作为固定剂,本研究结果证实膜过滤法鞭毛染色效果明显优于平坂培养和肉汤培养离心法12 3.肉汤培养离心方法需要2次离心,每次20min并且需要加入甲醛作为固定剂,这样操作会使菌体不易散开,有时聚集成团,背景不干净()膜过滤法完全克服了这些缺点,操作快速,鞭毛细胞染色率高。平板培养副溶血弧菌使用蒸馏水制成菌悬液后离心后很难见到侧鞭毛细胞()而膜过滤法仍可见侧鞭毛()这可证明膜过滤法不会对鞭毛有太大的损伤。有些菌株更适合于膜过滤染色鞭毛这可能因为平板培养产生的一些代谢产物会干扰鞭毛染色,而通过膜过滤方法,可把这些干扰物质清洗掉。

  本研究根据改变了鞭毛肉汤的培养基配方,增加了营养成分Proteosepeptone和酵母提取物,使细菌生长快速,同时也利于鞭毛的生长发育,对于快速生长的细菌培养4h就可以鞭毛染色,而不需要培养过夜。以前的研究均用羊血琼脂平板培养基123561和鞭毛肉汤培养基比较除了琼脂成分外,其他成分也不同,这也可能会影响鞭毛细胞染色率,因为有指出|41,培养基中葡萄糖和甘露糖会抑制细菌的鞭毛发育。本研究为了比较琼脂平板培养和鞭毛肉汤培养鞭毛细胞染色率差别,这两者的基本营养成分相同,只是琼脂平板中含有琼脂,而鞭毛肉汤不加而已,这样只是培养基固体还是液体这种单一因素对鞭毛细胞染色率的影响。

  本研究通过计算鞭毛细胞染色百分率这种评价染色方法比以前的研究1131更为可靠。以前的研究评分只能是模糊的不能完全定量化。有些肠杆菌科菌株鞭毛细胞数很少,以前的研究证明有些肠杆菌科细菌表现为弱动力171,这些鞭毛细胞数少的菌株是否就是弱动力菌株有待进一步研究。

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