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凝胶过滤层析参数对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响
作者:管理员    发布于:2015-10-17 11:16:06    文字:【】【】【

  凝胶过滤层析参数对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响安春菊,李德森,赵素然,杜荣骞*(南开大学生命科学学院,天津3⑴071)凝胶过滤介质种类、层析柱直径、柱床高度、洗脱流速均能不同程度地影响家蝇蛋白粗提液的分离效果。在实验范围内,选择1.3cm直径、40cm柱床高度的Sephadex075,以0l4ml/m的流速洗脱时,对家蝇蛋白粗提液的分离效果比较理想。

  凝胶过滤层析又称分子排阻层析、分子筛层析等,它是利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(凝胶)为填料,通过洗脱液的连续洗脱,使混合物中的各种物质按其分子体积大小和形状的差异而得到分离,已广泛应用于大分子物质的去盐、溶液的浓缩、分离提纯及分子量测定等方面(杨歌德等,2002)。凝胶过滤层析具有设备简单、操作方便、分离迅速和不影响样品生物活性等优点,但凝胶过滤层析对蛋白混合物的佳分离效果受许多因素的影响。我们探讨了凝胶过滤介质、层析柱直径、柱床高度、洗脱流速对家蝇Muscadomestica蛋白粗提液分离效果的影响,为凝胶过滤层析分离家蝇功能蛋白的应用提供了可靠的实验数据。

  1材料与方法1.1材料家蝇幼虫由本实验室饲养,按照王颖等(1999)的方法提取家蝇幼虫总可溶蛋白,-20*C保存备用。

  恒流泵,BSZ-100自动部分收集器购自上海沪西分析仪器厂;752N型紫外可见分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司。

  1.2方法1.2.1凝胶过滤介质对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响:将用0.05mol/LNH4Ac缓冲液(pH5.1)充分溶涨好的SephadexG-50、G-75和G-200参照童望宇等(2002)的方法分别进行装柱(0用005mol/LNH4Ac缓冲液(pH5.1)平衡至A280<0.002,加入相同体积的样品,以0.速用005moVLNH4Ac缓冲液(pH5.1)连续洗脱,每5min收集一管于280nm测定吸光值,待A280<0.002后停止洗脱。

  基金项目:天津市自然科学基金项目(033604911)昆虫学报48卷1.2.2凝胶过滤柱直径对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响:将用0 5.1)充分溶涨好的SephadexG-75参照童望宇等(2002)的方法分别装入直径为0.9an、1.3cm和1.7cm的玻璃层析柱中,柱床高度均为40 an,余下操作步骤同1.2.3凝胶过滤柱高度对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响:将用005 mo/LNH4Ac缓冲液(pH5.1)充分溶涨好的SephadexG-75参照童望宇等(2002)的方法装入直径为1.7 cm的层析柱中,保持柱床终高度分别为35cm、40cm和45cm,余下操作步骤同1.2.4洗脱流速对家蝇蛋白粗提液分离效果的影5.1)充分溶涨后参照童望宇等(2002)的方法装柱(1.7 cmx40cm),完全平衡后加入相同体积的样品,分别以025ml/min、0.4mL/min和0.5ml/min的流速进行洗脱,余下操作步骤同1.2.1节。

  2结果与分析2.1凝胶过滤介质对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响家虫蝇蛋白粗提液通过SephadexG-50、G-75和G-2003种不同规格的凝胶过滤介质层析后,混合物样品均得到分离,但波峰形状不同,即分离效果有所区别()。经Sephadex G-50、G-75和G-200层析后,依次出现了2个、3个和4个层析峰,且G-50和G-75展现出的个峰比G-200尖锐。G-75层析后,将G-50和G-200展现出的个峰进一步分离成两个小峰。可见不同规格的凝胶过滤介质对家蝇蛋白粗提液的分离效果不同,在所实验的3种介质中,Sephadex G-75的分离效果好。

  2.2凝胶过滤柱直径对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响家蝇蛋白粗提液经同一高度不同直径的SephadexG-75凝胶过滤柱层析后,均展现出4个明显的层析峰,但波峰形状有所不同,即分离效果有所差异()。选用直径为1.7 cm的层析柱时,前2个峰相对于直径为0. 3cm的层析柱来说不够尖锐,而直径为0.9cm的层析柱分离后展现出的第4个峰相对于直径为1.3cm和1.7cm的层析柱来说不够明显,可见在本实验所选定的3个层析粗提液的分离效果较为理想。

  凝胶过滤介质种类对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响柱的直径中,以直径为1 3cm的层析柱对家蝇蛋白腿脱呢―加4饮她1期安春菊等:凝胶过滤层析参数对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响2.3凝胶过滤柱高度对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响家蝇蛋白粗提液经同一直径不同高度的SephadexG-75凝胶过滤柱层析后,洗脱曲线见。

  3条曲线中,前2个峰的形状区别不大,但柱床高度为40cm和45cm时,第3个洗脱峰后还有一个不太明显的小峰,且仅就该峰而言,前者比后者的效果要好。当柱床高度为35cm时,该小峰没有展现出来。因此,在本实验所选择的3个柱床高度中,40cm的柱床高度对家蝇蛋白粗提液的分离效果更为理想。2.4洗脱流速对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响凝胶过滤柱(1.7cmx40cm),分别以025ml/min、0.4ml/min和0.5ml/min的流速洗脱后,洗脱曲线见。当以0.5mL/min的速度洗脱时,只展现出3个峰;以0.25mL/min和0.4mL/min的速度洗脱时,在前者的第3个峰后紧挨着又出现一个不明显的小峰,总共展现出4个峰。且仅就第1、第2个峰的峰形而言,以0. 5ml/min的速度洗脱时的分离效果更好一些。综合考虑,在本实验所选择的3个洗脱流速中,以0. 4mL/min的流速对家蝇蛋白粗提液的分离效果好。

  洗脱流速对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响3讨论围依次是1.5x 5x1036x105D(杨歌德等,2002)。家蝇蛋白粗提液的分子量范围大约是2. 1036.5x104D(安春菊等,2003),G-50和G-200大排阻极限分别过小和过大,均不能很好地对家蝇蛋白粗提液进行分离,只有G- 75的分离范围较为适宜,故分离效果好。

  凝胶过滤层析柱的直径也是影响蛋白分离效果的因素之一,根据经验,层析柱的直径一般在15cm之间,小于1cm会产生管壁效应,大于5cm则稀释现象严重。在一定范围内,随着层析柱直径的增加,液体流动的不均匀性也会随之增加,导致分辨率明显下降。本实验也证明了这一点,选用直径1.7cm的层析柱时,前2个蛋白峰的分离效果明显不如直径为09cm和1.3cm层析柱的分离效果。

  凝胶过滤层析柱对混合物样品的分离效果很大程度上取决于适宜的柱床高度。从理论上讲,只要柱床足够高,就能获得理想的分辨率,但由于软凝胶柱过高会挤压变形,且柱长增加会使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。柱床高度过低则进入凝胶颗粒微孔内部的样品分子由于行程过短也得不到有效的分离。本实验所选择的3个柱床高度中,35cm和45cm高的层析柱对家蝇粗提液中分子量较小物质的分离效果均不及40cm高度的层析柱。

  由于凝胶过滤层析的分离机理尚未完全明了,其分离效果与洗脱流速之间的关系还没有一个定论,不同的实验结果分歧很大,甚至得出截然不同的结论(童望宇等,2002)。究其原因可能是各种物质的理化性质各不相同,在分离过程中不可能与凝胶完全排阻,还存在其他作用影响其分离效果。本实验选择了和0.5mL/min3个洗脱流速,结果表明流速过慢或过快,其分离效果均不是很好,只有以0.4mL/min的流速洗脱时,总体分离效果理想,推测家蝇蛋白粗提液与凝胶间可能存在着如络合反应之类的非物理作用。

  此外,实验过程中还发现除了以上4个影响因素外,层析柱的装填、样品溶液的粘度及进样体积等也会影响凝胶过滤层析对家蝇蛋白粗提液的分离效果,可见要对家蝇蛋白粗提液取得好的分离效果,是有必要寻找一个合适的过滤参数的。我们已经通过本实验选择的层析条件结合离子交换层析得到了一种电泳纯的抗菌蛋白(另文发表)。

  不同规格凝胶颗粒介质的孔隙大小不同,即筛

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